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本试剂盒可以快速便捷分离培养细胞的线粒体，并可以制备进行线粒体蛋白变性或BN电泳的样品。试剂盒的提取缓冲系统不含任何表面活性剂和螯合剂EDTA，分离获得的线粒体纯度较高，并且绝大部分分离获得的线粒体都含有完整的内膜和外膜，可以用于线粒体的生理功能等方面的研究。另外，优化的裂解配方配套离心柱法有效裂解细胞，省去了经典方法使用玻璃匀浆器的繁琐操作，更加省时省力。同时，本试剂盒在分离线粒体的同时可以获得去除线粒体的细胞胞浆蛋白，可以研究线粒体蛋白向胞浆内的运输机制。

本试剂盒约30分钟即可完成培养细胞线粒体的提取。线粒体是在温和、非变性条件下提取的，结合不同的溶解液，溶解后的线粒体可以用于SDS-PAGE变性电泳检测、Blue Native非变性电泳检测等。另外，提取的线粒体具有生理功能，可以用于线粒体的生理功能等方面的研究。

• 离机请调整成RCF/g模式，按照离心力设置离心机（不要根据转速rpm模式设置），所有离心步骤都需要在4℃低温离心机中进行。
  
• 将分离缓冲液A，分离缓冲液B，漂洗缓冲液和贮存缓冲液混匀后放置于冰上。将离心柱套入2mL连盖收集管中，盖好管盖，放置于冰上预冷。
  
• 蛋白提取推荐添加蛋白酶抑制剂(自备，试剂盒不提供），根据蛋白酶抑制剂母液浓度提前添加在膜蛋白提取溶液中（如抑制剂母液是100×，添加时按照1:100添加，即1mL膜蛋白提取溶液添加10μL抑制剂）。研究蛋白磷酸化，需要添加磷酸酶抑制剂(自备，试剂盒不提供)。
  
• 蛋白定量推荐使用BCA方法，可以选择BCA蛋白浓度试剂盒(货号：RFT057)。

• 准备溶液
  常温溶解试剂盒中的各种溶液，溶解后立即置于冰上并混匀。如果最终实验目的是制备线粒体蛋白样品，根据样品数量，取适量体积分离缓冲液A加入蛋白酶抑制剂。按照下表大体估算分离缓冲液A的使用体积：
  

  细胞类型	培养器皿	细胞数量	细胞沉淀体积(PCV)(μL)	分离缓冲液A(μL)
  悬浮细胞		~2×107	~200	250
  贴壁细胞	96孔板	~1×105	调整细胞数目到2×107	250
  	24孔板	~5×105
  	6孔板	~2.5×106
  	25cm2培养瓶	~2×106
  	75cm2培养瓶	~8×106
  	35mm培养皿	~2×106
  	60mm培养皿	~5×106
  	100mm培养皿	~1.5×107

  • (二百万，2×10⁶)HeLa细胞，其细胞沉淀体积（PCV）大约为20μL。
• 收集细胞
  
  • 对于贴壁细胞：细胞用PBS漂洗一遍，弃PBS；再加入适量PBS，用细胞刮刀刮下细胞，或用0.02% EDTA（0.5mM）溶液处理细胞使细胞不再贴壁很紧，并用移液器吹打下细胞。400g（~2000rpm） 4℃离心5min收集细胞，尽最大努力吸尽上清，留下细胞沉淀备用。尽量避免用胰酶消化细胞，以免胰酶降解需提取的目的蛋白。
    
  • 对于悬浮细胞：400g（~2000rpm）4℃离心5min收集细胞，用PBS洗一遍，离心收集细胞，尽最大努力吸尽上清，留下细胞沉淀备用。
• 裂解细胞膜
  
  • 细胞沉淀中加入250μL准备好的分离缓冲液A（含蛋白酶抑制剂），用移液器吹打重悬细胞沉淀，涡旋剧烈震荡30～60秒，冰浴处理10分钟，间歇2-3混匀。
    
    • 建议将起始细胞数不要低于2×10⁷，否则将导致最后线粒体得率过低。
  • 将细胞悬液转移到离心柱中，盖上管盖，16000g（~13000rpm） 4℃离心1分钟，离心后收集管底部会有沉淀形成。
    
    • 离心柱最大体积为600μL；确保离心机可以在10秒内达到16000g。
  • 弃去离心柱，盖好2mL收集管管盖，用1mL移液器轻柔吹打重悬收集管中的沉淀。
• 去除细胞核和未破碎的细胞
  溶液700g（~2700rpm） 4℃离心1分钟，用200μL吸头小心将上清（上清稍有浑浊）转移到新的1.5mL离心管中。注意：转速不要超过700g，否则会降低线粒体的得率。
  关键步骤：吸取上清时不要触及沉淀，甚至可以丢弃部分上清不吸取，以免上清（含线粒体）中污染核蛋白。如果使用250μL分离缓冲液A，建议吸取200μL上清。此步骤得到的细胞核纯度不高，混杂有没有完全破碎的完整细胞，不建议用于相关实验。
  
• 收集线粒体
  
  • 上清中加入等体积的分离缓冲液B（如步骤4吸取200μL上清，则加入200μL分离缓冲液B），混匀；
    
  • 16000g（~13000rpm） 4℃离心10分钟，用200μL吸头吸去上清，沉淀即为提取的线粒体。上清是胞浆蛋白，如需要可保存备用。
    关键步骤：此步骤必须完全将上清吸取干净，可以用200μL吸头分次吸取上清，最后用10μL吸头将残余上清彻底吸净，以免线粒体中污染胞浆蛋白。
• 线粒体漂洗
  线粒体沉淀中加入0.5mL漂洗缓冲液，轻柔重悬沉淀，16000g，4℃离心5分钟，弃上清，沉淀即为漂洗后的线粒体。
  
• 线粒体的使用
  
  • 线粒体功能研究
    如果用于完整线粒体的功能或酶活性研究，初始2×10⁷细胞分离得到的线粒体样品中加入100～150μL线粒体贮存缓冲液，重悬线粒体后-80℃备用。不建议长期贮存，尽快使用。
    
  • 线粒体蛋白电泳
    
    • 线粒体蛋白变性样品处理（SDS-PAGE）
      ① 初始2×10⁷细胞分离得到的线粒体沉淀中建议使用50μL变性蛋白溶解液溶解线粒体沉淀；
      ② BCA蛋白浓度试剂盒(货号：RFT057)；
      ③ 用变性蛋白溶解液调整蛋白浓度为1μg/μl，按需分装，每管50μL，-80℃保存待用；
      ④ 取一管50μL样品加入SDS-PAGE上样缓冲液（货号：RFT071、RFT241、FRT477）处理，建议调整上样液浓度为0.5μg/μl；对于多次跨膜蛋白的变性电泳检测，样品建议使用37℃处理30分钟，不要95℃加热5分钟，因为在95℃高温情况下，多次跨膜蛋白极易聚集形成多聚体，样品会聚集，WB检测会表现为比实际蛋白大小更大的分子量；
      ⑤ 使用SDS-PAGE凝胶电泳，每个泳道上样10～40μL（5～20μg）。
      
    • 线粒体蛋白BN非变性样品处理
      准备即用型膜蛋白增溶液A：
      

      成分	用量
      增溶剂粉末（DDM）	50mg
      溶解缓冲液（2×）	2.5mL
      灭菌水	补至5mL

      • 建议一次全部配制，由于粉末蓬松状态，不建议称取粉末后分批配制。
        
      • 一定是用水补到5mL刻度线（由于粉末体积影响，不要直接加入2.5mL水），轻柔混匀，避免产生大量气泡。
        
      • 配制好的即用型膜蛋白增溶液-20℃贮存，尽量避免反复冻融。
      ① 初始2×10⁷细胞分离得到的线粒体沉淀中建议使用50μL膜膜蛋白重悬液(BN电泳用)重悬线粒体沉淀；
      ② BCA蛋白浓度试剂盒；
      ③ 用膜蛋白重悬液(BN电泳用)调整蛋白浓度为1μg/μl，按需分装，每管50μL，-80℃保存待用；
      ④ 取一管50μL样品，溶化混匀后4℃ 16000g 5分钟，去除上清，保留沉淀；
      ⑤ 沉淀中加入50μL膜蛋白增溶液A，轻柔重悬沉淀，尽量不产生气泡，冰浴10分钟；
      ⑥ 4℃ 16000g 15分钟，取上清至一干净1.5mL离心管中即为增溶后线粒体蛋白溶液（小心不要吸取沉淀），此时得到的线粒体蛋白浓度为1μg/μl，其中去垢剂DDM（n-Dodecyl β-D-maltoside，β-DM，n-十二烷基-β-D-麦芽糖苷）终浓度为1%；
      ⑦ 线粒体蛋白溶液中加入1/10体积10×膜蛋白A型上样缓冲液(货号：RFT472)（配套膜蛋白增溶液A使用），使用BN凝胶电泳（RFT462/RFT463/RFT471），每个泳道上样5～20μg。
      
    • 线粒体蛋白等电聚焦样品处理（2D凝胶第一维电泳）
      建议线粒体沉淀中使用溶解液:7M尿素，2M硫脲，2%CHAPS,20mM DTT(自备)。
• 线粒体产量和质量的评价
  
  • 线粒体产量
    

    细胞系	细胞数量	线粒体蛋白
    K562	2×107	100～150μg
    Jurkat	2×107	80～100μg
    Hela	2×107	100～150μg
    NIH-3T3	2×107	80～120μg

  • 线粒体质量评价
    线粒体质量评价首先看提取的线粒体是否具有完整的内外膜结构（进行线粒体功能活性研究），其次要看裂解后的线粒体蛋白是否有明显的富集，其三要看裂解后的线粒体蛋白是否有其他组分交叉污染，最后看提取的线粒体中是否可以检测出目的蛋白。使用专门的线粒体内参检测（下表），可以初步确认提出的是线粒体蛋白。线粒体蛋白是否有效富集需要用总蛋白作为对照，与总蛋白相比，线粒体内参蛋白是否有明显富集。线粒体蛋白中的交叉污染可以用其他组分内参检测线粒体蛋白样品，如关注线粒体蛋白中是否有胞浆蛋白污染，可以使用胞浆蛋白内参检测线粒体蛋白，检测条带的强弱即说明线粒体蛋白与胞浆蛋白交叉污染的程度。用目标蛋白抗体检测线粒体蛋白，验证是否可以检测到目的蛋白，蛋白大小是否符合预期。
    

    位置	内参名称	大小kD
    细胞膜	Na-K ATPase	100
    内质网膜	Calnexin	~90
    线粒体膜	COX IV	17

    许多研究人员利用WB对分离的线粒体蛋白进行纯度检测，经常发现一些常用的胞浆内参能在线粒体蛋白中检测到，例如β-actin,GAPDH和β-tubulin，这是由于这些胞浆内参不仅存在于胞浆也存在于线粒体中，因此可以在线粒体蛋白中检测到胞浆内参。